肿瘤坏死因子-α抑制狼疮鼠（MRL/lpr）骨髓间充质干细胞成骨分化参与骨质疏松机制的体内研究

摘要：目的：探讨TNF-α抑制骨髓间充质干细胞（BMMSCs）成骨分化参与SLE骨质疏松的分子机制。方法分离狼疮鼠（MRL/lpr）及对照鼠（C3H/HeJ）股骨制备组织切片，苏木精-伊红（HE）染色观察骨质情况；免疫组织化学法观察骨TNF-α、NF-κB P50、骨形态发生蛋白-2（BMP-2）、磷酸化Smad（PSmad）1/5/8蛋白表达；分离培养狼疮鼠及对照鼠BMMSCs，爬片后免疫组织化学法观察上述4种蛋白表达情况；定向诱导BMMSCs向成骨细胞分化，ALP染色鉴定早期成骨情况，将BMMSCs与羟基磷灰石共孵育后植入裸鼠皮下，行HE染色及Masson染色观察异位成骨情况；将狼疮鼠皮下注射重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白（rhTNFR：Fc）及0.9%氯化钠注射液，4周后观察上述蛋白表达及异位成骨情况。图像分析采用Image-pro plus 6.0软件，2组间比较采用t检验。结果 MRL/lpr鼠骨皮质较对照组减少，皮质骨占骨体积百分比较对照鼠减低[（13.96±0.25）%与（23.61±0.71）%，3只，P<0.01]；狼疮鼠股骨TNF-α、NF-κB P50蛋白的表达较对照组增高（0.643±0.051与0.405±0.022，0.917±0.023与0.650±0.032，3只， P<0.01），BMP-2表达较对照鼠明显减少（0.52±0.03与0.72±0.03，3只，P<0.01），PSmad1/5/8蛋白的表达在两者间差异无统计学意义（1.264±0.021与1.301±0.044，3只，P>0.05）；细胞爬片显示狼疮鼠BMMSCs TNF-α、NF-κB P50表达较对照鼠明显增强（0.184±0.021与0.136±0.013，0.132±0.021与0.097±0.014，3只，P<0.01），BMP-2、PSmad1/5/8表达则明显减弱（0.128±0.013与0.216±0.221，0.115±0.023与0.196±0.034，3只，P<0.01）；狼疮鼠BMMSCs成骨诱导7 d ALP活性较对照组减低，HE染色及Masson提示狼疮鼠BMMSCs体内异位成骨能力较对照组减弱。注射rhTNFR：Fc组狼疮鼠骨组织骨小梁较0.9%氯化钠注射液组明显增多（21.8±1.0与14.3±0.6，3只，P<0.01），股骨TNF-α、NF-κB P50蛋白表达较0.9%氯化钠注射液组减低（0.540±0.024与0.682±0.031，0.857±0.023与1.098±0.044，3只，P<0.05），BMP-2的表达则较0.9%氯化钠注射液组增高（0.99±0.04与0.85±0.04，3只，P<0.05），PSmad1/5/8蛋白的表达亦增高，但差异无统计学意义（0.88±0.08与0.84±0.04，3只，P>0.05）；注射rhTNFR：Fc组狼疮鼠BMMSCs异位成骨能力较未注射组有所增加，但仍低于对照组。结论 TNF-α通过抑制Smad信号通路而抑制 BMMSCs成骨分化，可能参与了狼疮鼠骨质疏松的发生。